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復(fù)雜代謝途徑的高效重編程是構(gòu)建高性能微生物細(xì)胞工廠的重要挑戰(zhàn)?？莶菅挎邨U菌作為具有GRAS安全認(rèn)證的工業(yè)底盤菌，在蛋白質(zhì)、維生素及類胡蘿卜素等高附加值產(chǎn)物的生物制造中具有應(yīng)用前景。然而，實(shí)現(xiàn)多基因精細(xì)調(diào)控以優(yōu)化復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)面臨技術(shù)瓶頸，傳統(tǒng)的質(zhì)粒文庫或啟動子/RBS替換方法難以在染色體原位實(shí)現(xiàn)多基因同時(shí)、精準(zhǔn)、可擴(kuò)展的調(diào)控，限制了其在代謝通路系統(tǒng)優(yōu)化中的應(yīng)用。近日，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員王猛團(tuán)隊(duì)基于前期開發(fā)的堿基編輯平臺BETTER，建立了枯草芽孢桿菌的多位點(diǎn)堿基編輯系統(tǒng)bsBETTER，實(shí)現(xiàn)了在枯草芽孢桿菌中對12個(gè)關(guān)鍵代謝基因同時(shí)調(diào)控，并在每個(gè)基因位點(diǎn)上獲得了256種理論核糖體結(jié)合位點(diǎn)組合中的255種變體，拓展了多基因表達(dá)調(diào)控的深度與分辨率。研究以番茄紅素合成為模型通路，靶向調(diào)控MEP途徑及下游合成模塊的12個(gè)關(guān)鍵基因，通過堿基編輯在染色體原位構(gòu)建高多樣性核糖體結(jié)合位點(diǎn)文庫，并結(jié)合高通量篩選和深度測序，獲得了番茄紅素產(chǎn)量提升6.2倍的工程菌株。多組學(xué)分析表明，bsBETTER介導(dǎo)的多基因協(xié)同調(diào)控重構(gòu)了MEP通路的代謝通量與氧化還原輔因子平衡，增強(qiáng)了糖酵解、磷酸戊糖途徑和TCA循環(huán)的整體代謝活性，提高了NADPH與ATP的再生能力，實(shí)現(xiàn)了系統(tǒng)層面的代謝重編程。研究同時(shí)揭示了不同基因核糖體結(jié)合位點(diǎn)強(qiáng)度的上下游依賴關(guān)系：上游限速酶基因保持中低表達(dá)更利于代謝平衡，下游關(guān)鍵合成酶的高強(qiáng)度表達(dá)可有效促進(jìn)產(chǎn)物積累。研究為進(jìn)一步提升篩選與驗(yàn)證效率，建立了兩個(gè)自動化高通量平臺體系。一是番茄紅素高通量篩選平臺，實(shí)現(xiàn)了從孔板發(fā)酵、自動化萃取到HPLC/UPLC-MS定量分析的全流程集成，可快速完成上萬株突變體的并行篩選與驗(yàn)證，提升了表型檢測通量和結(jié)果準(zhǔn)確性；二是基于CRISPR的自動化基因組編輯與驗(yàn)證平臺，可實(shí)現(xiàn)從編輯質(zhì)粒設(shè)計(jì)與構(gòu)建、突變體構(gòu)建、質(zhì)粒清除到菌株培養(yǎng)及熒光驗(yàn)證的全自動化操作，提高了多基因編輯效率與重現(xiàn)性，為復(fù)雜代謝調(diào)控提供了標(biāo)準(zhǔn)化工程基礎(chǔ)。相比于傳統(tǒng)的啟動子工程或CRISPRa/i方法，bsBETTER無需外源供體模板、不依賴重組、無雙鏈斷裂，具有高效率、強(qiáng)宿主適配性與可擴(kuò)展性等優(yōu)勢，為多基因通路的優(yōu)化和系統(tǒng)重構(gòu)提供了新技術(shù)路徑，有望推廣應(yīng)用于維生素、色素、脂肪酸及多肽等多類高附加值化合物的生物制造過程。相關(guān)研究成果在線發(fā)表在《代謝工程》（Metabolic Engineering）上。研究工作得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)的支持。論文鏈接自動化高通量平臺體系